用熒光疊氮化物探針通過CuAAC可視化炔烴標記的生物分子的一個主要缺點反應是需要去除未反應的熒光探針。當對細胞內(nèi)環(huán)境、活體組織成像或?qū)w內(nèi)生物分子進行可視化時，這尤其成問題。去除所有未反應的熒光探針的困難也是背景信號和非特異性結(jié)合的主要原因之一。

為了克服這一缺點，Carolyn Bertozzi小組設(shè)計了熒光疊氮化物探針，通過銅催化或無金屬點擊化學。這些疊氮化物探針在與炔烴反應之前不具有熒光性。已終止在CalFluor中，這些探針具有從綠色到遠紅色波長的發(fā)射最大值，并且能夠?qū)崿F(xiàn)靈敏無洗滌條件下的生物分子檢測。許多報告表明，CalFluor探針是用于敏感可視化細胞中代謝標記分子（聚糖、DNA、RNA和蛋白質(zhì)）的工具，正在開發(fā)在不洗滌的條件下將動物腦組織切片、斑馬魚和小鼠腦組織切片。